利用花粉介導(dǎo)附加超聲波處理進行轉(zhuǎn)基因，其超聲波各處理參數(shù)對花粉萌發(fā)及基因轉(zhuǎn)化有極大的影響。我們已利用超聲波處理蘋果花粉作了初步的研究，結(jié)果表明，超聲波處理的間隙時間不是影響花粉萌發(fā)的主要因素，處理功率、工作時間和處理次數(shù)才是影響花粉萌發(fā)的主要因素，而且各因素之間也有一定的影響。因此，我們利用葡萄花粉按四因素二次回歸正交組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計確定試驗方案，擬通過該組試驗獲得超聲波處理參數(shù)的*組合，并考察因素效應(yīng)和因素間交互作用的顯著性。
1材料和方法11花粉采集供試葡萄品種為玫瑰香和瑰寶，試材取自山西省農(nóng)業(yè)*果樹研究所葡萄資源圃。采集兩供試品種即將開放的花朵，摘下花蕾，在室溫下陰干捻碎過篩，收集篩好的花粉，保存于4冰箱內(nèi)。
12質(zhì)粒提取采用堿裂解法提取含有GUS報告基因的質(zhì)粒。
13緩沖液制備緩沖液選用25蔗糖，50mg/LH3BO3，500mg/LCa（NO3）2、4H2O，200mg/LMgSO4、7H2O，100mg/LKNO3。固體培養(yǎng)基是在其中加1的瓊脂。
14超聲波處理選擇功率、處理時間、間隔時間和處理次數(shù)4個超聲波處理參數(shù)為試驗因素，破碎（恒碩超聲機械專業(yè)創(chuàng)新締造世界*品牌）率和萌發(fā)率為測定指標(biāo)，按四因素二次回歸正交組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計確定試驗方案（，2）。擬通過該組試驗獲得超聲波處理參數(shù)的*組合，并考察因素效應(yīng)和因素間交互作用的顯著性?；ǚ圻M行超聲波處理時均是取002g花粉在1mL液體緩沖液中按試驗方案處理。
處理后的花粉，一部分直接滴在載玻片上，顯微鏡下觀測花粉的破碎率；另一部分播在固體培養(yǎng)基中，在25恒溫下培養(yǎng)2h，顯微鏡下觀測花粉的萌發(fā)率。
花粉萌發(fā)以花粉管伸長超過花粉直徑為標(biāo)準(zhǔn)。
花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)/總花粉數(shù)？100；花粉破碎率=破碎花粉數(shù)/總花粉數(shù)？100.
15GUS檢測加質(zhì)粒處理后的花粉在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)2h后，在37恒溫下經(jīng)XGluc染色液染色，顯微鏡下觀測染色情況。染色液成分為1mg/mLXGluc，05mmol/LK3[Fe（CN）6]，05mmol/LK4[Fe（CN）6]，003Triton100，01mol/L磷酸緩沖液（pH70）。
2結(jié)果與分析21超聲波處理參數(shù)的選擇從可以看出，花粉破碎率過高會大大影響花粉的萌發(fā)，而較低的花粉萌發(fā)率直接影響坐果率。
但破碎率過低，說明強度小，質(zhì)粒進入花粉的幾率就會大大降低。因此，只有選擇適宜的破碎率，才可兼顧萌發(fā)率和質(zhì)粒導(dǎo)入的要求，選出*處理參數(shù)。
采用SAS軟件對試驗結(jié)果進行分析，結(jié)果表明，超聲波處理的功率、處理時間和處理次數(shù)對花粉破碎率和萌發(fā)率有極顯著影響，而間隔時間對花粉破碎率和萌發(fā)率的影響不顯著，同時功率與處理時間的交互作用顯著，處理時間與處理次數(shù)的交互作用極顯著。
考察顯著性檢驗結(jié)果，試驗花粉破碎率和萌發(fā)率的穩(wěn)定性，在不破壞DNA的基礎(chǔ)上，超聲波處理參數(shù)以功率100120W，處理時間45s，間隙時間26s，處理次數(shù)6為*組合選擇范圍。
22GUS檢測花粉和質(zhì)?；旌虾笫褂幂^優(yōu)的超聲波參數(shù)進行處理，即功率100120W，處理時間5s，間隙時間5s，處理次數(shù)6.花粉經(jīng)處理后，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后用XGluc染液37恒溫進行染色，如果花粉中轉(zhuǎn)入GUS基因，則花粉及花粉管顯藍(lán)色。
本試驗中，在對照中沒有檢測到內(nèi)源GUS活性，處理檢測到花粉顯藍(lán)色均為基因?qū)隚US內(nèi)，檢測到花粉的轉(zhuǎn)化率為4.
3討論葡萄花粉結(jié)構(gòu)的特殊性造成質(zhì)粒進入花粉困難。在掃描電鏡下觀測到葡萄絕大部分品種的花粉萌發(fā)孔屬三溝孔類型，也就是說這些品種的花粉壁上有3條溝，萌發(fā)孔位于3條溝里，萌發(fā)孔上都附有乳頭狀突起，當(dāng)花粉開始萌發(fā)時，這個附著物脫落并在這個位置上顯露出圓環(huán)狀的洞，以利花粉的萌發(fā)。因此使用超聲波處理使質(zhì)粒進入花粉內(nèi)有一定的困難，幾率相對其他果樹低許多。
葡萄花粉含有很多酶、蛋白質(zhì)、核酸及其他有生命活性的物質(zhì)，這些物質(zhì)在花粉保存過程中極易變性，從而導(dǎo)致花粉生活力下降以致喪失。干燥花粉在0保存30d生活力下降56394。本試驗中使用的花粉未經(jīng)保存時的萌發(fā)率為4550，進行超聲波處理參數(shù)選擇時，花粉因保存在4冰箱中時間長，生活力已下降至30.不經(jīng)過任何處理時，花粉的破碎率為2541，萌發(fā)率為1953.
花粉萌發(fā)過程中，花粉和柱頭釋放的核酸酶均降解外源DNA，可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)化失敗的重要原因之一。溫度、pH和一些化學(xué)試劑能影響花粉中核酸酶活性。如：提高培養(yǎng)基中EDTA或MgSO4濃度等；KNO3或PEG可抑制DNA酶活性而不影響轉(zhuǎn)化后花粉的萌發(fā)。因此，在試驗中應(yīng)盡量降低花粉萌發(fā)過程中核酸酶活性，獲得高頻率穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
植物組織中是否存在內(nèi)源GUS，關(guān)系到在植物遺傳轉(zhuǎn)化實驗中使用GUS報告基因的可靠性。GUS組織化學(xué)檢測的條件因材料而異，細(xì)菌GUS通常在pH70的條件下檢測，而植物內(nèi)源GUS活性檢測的pH則有不同的報道。本試驗中葡萄花粉在pH70條件下沒有檢測到內(nèi)源GUS活性，大大提高了試驗的可靠性。
超聲波處理各參數(shù)對花粉有極顯著影響，而且參數(shù)間存在交互作用。因此，用超聲波處理選擇參數(shù)時，應(yīng)考慮其交互作用。各種植物花粉的大小、形態(tài)、花粉壁結(jié)構(gòu)及花粉表面的附著物均對質(zhì)粒進入花粉內(nèi)部有極大的影響，因此針對不同種植物、同一植物不同品種，均應(yīng)選擇合適的培養(yǎng)基和超聲波處理參數(shù)，使得利用花粉作為外源基因的載體進行遺傳轉(zhuǎn)化有更高的轉(zhuǎn)化效率。
