監(jiān)管變革：從回避熒光到擁抱精準

前些年，細胞株開發(fā)領域對熒光細胞篩選技術持謹慎態(tài)度，主要體現在外源DNA/蛋白引入，用于生產治療性蛋白（如抗體）的細胞株開發(fā)中，監(jiān)管機構（如FDA、EMA）要求最終的生產細胞株盡可能“干凈”，引入熒光蛋白基因及其伴隨的選擇標記基因（如抗生素抗性基因）被視為不必要的外源遺傳物質，增加了產品的復雜性和潛在安全風險（如免疫原性）。這些外源基因必須在最終的生產主細胞庫和工作細胞庫中被移除或證明不存在，這增加了額外的驗證成本、負擔和風險。

近兩年熒光標記技術興起的轉機來自于一項融合人工智能與基因編輯的可將生物藥開發(fā)時間從6個月縮短至1.5個月的創(chuàng)新技術-智能定點整合。在2024年BPI US West會議上，Pfizer、Genentech、Takeda等紛紛展示了各自的定點整合平臺：Pfizer采用雙質粒雙位點策略，通過BxB1整合酶將兩個不同載體分別整合到兩個獨立位點，用紅綠熒光標記篩選無熒光轉化子。

Pfizer演講現場（BPI US West展會）[1]

Genentech則開發(fā)了單一位點多質粒順序整合技術，成功實現了一個knob-into-hole雙抗的11g/L高表達；AbbVie和MSD的聯合分析顯示，傳統(tǒng)細胞株開發(fā)平均耗時24-28周，而定點整合技術可縮短70%以上時間。

Genentech演講現場（BPI US West展會）[1]

國內也有一些定點整合平臺，如大灣生物AlfaCell平臺已與鼎康生物CDMO平臺深度整合，為客戶提供全流程加速服務；博安生物則在2024年10月推出了BA-Fastcell®平臺[2]。

技術革新：智能定點整合的本質突破

智能定點整合技術（Intelligent Site-Specific Integration，SSI）是基因編輯技術、人工智能算法與自動化設備的融合。與傳統(tǒng)隨機整合（RTI）相比，它實現了從“盲目撒網”到“精準投放”的根本轉變。

SSI帶來的變革主要體現在四個關鍵維度：

開發(fā)速度飛躍

將傳統(tǒng)24-28周的周期壓縮至6周。大灣生物展示的數據顯示，從DNA轉染到獲得研究細胞庫（RCB）僅需1.5個月。深圳太力生物的服務明確承諾1.5個月內交付穩(wěn)定高產單克隆。

產量質量雙升

表達量普遍達5g/L以上，是傳統(tǒng)方法的1.5-2倍。更值得關注的是，雙抗正確配對率突破80%，產品純度可達98.8%。穩(wěn)定性也顯著提升，達到100 %穩(wěn)定性傳遞。

成本大幅降低

僅用“1塊96孔板”即可完成單克隆篩選，避免大量重復工作。Pfizer等企業(yè)的實踐表明，定點整合技術可減少30%以上的開發(fā)成本。

監(jiān)管路徑優(yōu)化

均一性高的細胞池獲得監(jiān)管機構認可，成為IND時間線突破的新窗口。在BPI Asia 2024會議上，專家指出定點整合細胞株的數據一致性顯著簡化了審批流程。

SSI核心技術采用兩步走策略：

第1步：熒光宿主細胞構建與篩選

利用CRISPR-Cas9等基因編輯工具，在CHO細胞基因組中篩選高轉錄活性區(qū)域，插入包含熒光蛋白（如GFP）及重組酶識別位點（如BxB1 attP位點）作為“著陸墊”（landing pad）。此階段需篩選獲得熒光均一、生長穩(wěn)健的單克隆宿主細胞。

第2步：目的基因精準整合與篩選

將包含目標基因（如抗體序列）和同源重組臂的表達載體導入宿主細胞，利用重組酶介導的位點特異性重組，將目標基因精準置換熒光標記。成功整合的細胞會失去熒光信號，成為“無熒光轉化子”。此階段需篩選出成功整合的無熒光的陽性克隆。

Cytena單細胞打印機在智能定點整合技術中的應用

宿主細胞篩選階段

基于熒光強度高效分選陽性宿主細胞，溫和的噴墨技術確保細胞活力。

目的基因整合后細胞篩選階段

目的基因整合后細胞篩選階段：在一群熒光細胞中反向精準分選無熒光細胞（即成功整合的細胞），其噴嘴圖像可提供單細胞來源的證據，單細胞率>95%。

Cytena設備的優(yōu)勢在于：分選溫和、快速、單細胞率高，熒光和非熒光細胞都能高效分選、使用無菌一次性墨盒杜絕交叉污染、結合成像設備可提供完整的克隆生長追蹤報告，滿足FDA單克隆源性要求。

智能定點整合單克隆篩選流程圖

站在生物制藥工業(yè)化的轉折點上，智能定點整合技術代表的不僅是效率提升，更是一種研發(fā)范式的根本轉變——從隨機試錯走向理性設計，從人工操作邁向智能自動化。

然而，一個不可忽視的現實是：市場上定制一個采用智能定點整合技術開發(fā)的優(yōu)質細胞株，價格往往高達上千萬人民幣。這對于許多研發(fā)管線豐富、項目迭代快的生物技術公司，尤其是處于發(fā)展關鍵期的Biotech而言，無疑是一筆沉重的負擔，讓不少企業(yè)望而卻步。這高昂的“入場券”，反而點燃了另一股燎原之火——越來越多的企業(yè)不再滿足于“購買服務”，而是開始戰(zhàn)略性“投資未來”，著手自主組建智能定點整合技術平臺！

自主平臺的構建離不開關鍵設備的投入，Cytena單細胞打印機是平臺的核心硬件，貫穿宿主細胞篩選和目的基因整合細胞篩選兩大關鍵步驟，確保高效率、高活力、合規(guī)的單克隆分離。

參考資料：

【1】筆者親歷丨定點整合殺瘋了的BPI US West現場

【2】博安生物定點整合細胞株開發(fā)平臺BA-Fastcell®亮相BPI Asia 2024