2023年5月22日，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所汪迎春團(tuán)隊(duì)在Molecular & Cellular Proteomics雜志上發(fā)表了題為“Parallel Proteomic Comparison of Mutants With Altered Carbon Metabolism Reveals Hik8 Regulation of PII Phosphorylation and Glycogen Accumulation in a Cyanobacterium”研究論文。該研究采用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)與PRM靶向蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的方法，并結(jié)合磷酸化占比率分析和后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，系統(tǒng)解析藍(lán)細(xì)菌碳代謝蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并揭示組氨酸激酶Hik8參與碳氮平衡的調(diào)控。
碳代謝是光合生物的核心代謝，涉及眾多蛋白質(zhì)的協(xié)同運(yùn)作和調(diào)控。在藍(lán)藻中，參與碳代謝的蛋白質(zhì)其表達(dá)受到多種因子的調(diào)控，包括RNA聚合酶σ因子SigE、組氨酸激酶Hik8、Hik31和其質(zhì)粒上的同源蛋白Slr6041，以及二元信號(hào)系統(tǒng)的響應(yīng)應(yīng)答因子Rre37。然而，目前還不完全清楚這些調(diào)控因子是如何特異或協(xié)同調(diào)控參與碳代謝的蛋白或蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。
為了解決這一問題，研究團(tuán)隊(duì)使用了Thermo Scientific™ Orbitrap質(zhì)譜儀結(jié)合TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)野生型和碳代謝調(diào)控因子的缺失突變體進(jìn)行了橫向的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。TMT定量蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)利用EASY-nLC 1000納升液相和LTQ Orbitrap Elite質(zhì)譜采集。蛋白質(zhì)組分析的整體策略如圖1A所示，通過在重復(fù)實(shí)驗(yàn)之間重新排列TMT標(biāo)記的順序，避免了由于每種TMT試劑導(dǎo)致的定量偏差(圖1B)。總共鑒定出2543種蛋白質(zhì)(覆蓋70%的藍(lán)藻蛋白)，其中2189種蛋白質(zhì)在至少兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中包含定量的TMT信息，用于進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)和生物信息學(xué)分析(圖1C)。
圖1.藍(lán)藻野生型與碳代謝調(diào)控蛋白突變株在光自養(yǎng)條件下的蛋白質(zhì)組定量鑒定(點(diǎn)擊查看大圖)
所有樣本的重復(fù)實(shí)驗(yàn)均正確聚類，表明定量具有高可重復(fù)性(圖2A)。研究團(tuán)隊(duì)通過學(xué)生t檢驗(yàn)(p < 0.05)和1.3倍的倍數(shù)變化閾值，分別在Δhik31、Δhik8、Δrre37、ΔsigE和Δslr6041中鑒定出40、116、49、78和129種差異表達(dá)蛋白(圖2B)。部分差異表達(dá)蛋白通過免疫印跡法進(jìn)一步驗(yàn)證，這些蛋白大多與碳代謝相關(guān)(圖2C)。
圖2.碳代謝調(diào)控因子突變體中差異表達(dá)蛋白的篩選
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為了更好地可視化至少被兩個(gè)碳代謝調(diào)控蛋白調(diào)控的蛋白質(zhì)，研究團(tuán)隊(duì)利用五個(gè)碳代謝調(diào)控蛋白作為中心節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建了一個(gè)包含80種在至少兩個(gè)突變株中發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖3)。該網(wǎng)絡(luò)清晰地展示了調(diào)控的交叉作用，這可能對(duì)藍(lán)藻的生長(zhǎng)以及應(yīng)對(duì)代謝和環(huán)境變化至關(guān)重要。
圖3. 碳代謝調(diào)控因子共同調(diào)控的差異表達(dá)蛋白
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糖原是藍(lán)細(xì)菌的關(guān)鍵碳源和能量?jī)?chǔ)存物質(zhì)。在黑暗條件下，糖原分解和細(xì)胞呼吸對(duì)細(xì)胞存活至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，Δhik8突變株中糖原含量顯著降低，而其他突變株未受影響(圖4A)。盡管Δhik8中糖原合成相關(guān)蛋白未顯著下調(diào)，這暗示可能存在一種新的Hik8依賴的糖原積累機(jī)制。糖原積累受細(xì)胞內(nèi)碳氮比(C/N平衡)調(diào)控，而該平衡通過蛋白PII的磷酸化狀態(tài)感知和調(diào)節(jié)。
研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，組氨酸激酶Hik8特異調(diào)控藍(lán)細(xì)菌碳氮的主要感受信號(hào)PII蛋白第49位絲氨酸(S49)的磷酸化(圖4B和C)。為驗(yàn)證PII S49位點(diǎn)磷酸化的上調(diào)以及其在Δhik8突變株中的調(diào)控作用，研究團(tuán)隊(duì)采用了PRM靶向蛋白質(zhì)組學(xué)方法，定量分析了野生型和Δhik8突變株在不同營(yíng)養(yǎng)條件下磷酸肽段的豐度。PRM靶向蛋白質(zhì)組學(xué)利用EASY-nLC 1000納升液相和Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 質(zhì)譜儀進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，在自養(yǎng)(AT)條件下，Δhik8中PII S49磷酸化水平顯著上調(diào)，且遠(yuǎn)超TMT定量結(jié)果(圖4D)?？紤]到磷酸化會(huì)改變肽段的電荷狀態(tài)，從而影響磷酸化肽段和非磷酸化肽段在質(zhì)譜分析中的電離效率和檢測(cè)靈敏度，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步計(jì)算了PII S49磷酸化占比率。結(jié)果表明，Δhik8中近70%的PII蛋白發(fā)生磷酸化，而野生型中不足4%(圖4E)。
圖4.Δhik8突變體中糖原含量的降低及PII磷酸化水平的上調(diào)
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進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Hik8的缺失導(dǎo)致PII S49磷酸化水平顯著上調(diào)，并伴隨突變體糖原含量和黑暗生存能力顯著下降，而將PII S49突變?yōu)楸彼嵋阅M其去磷酸化狀態(tài)則能恢復(fù)Hik8缺失突變體的糖原含量和黑暗條件下的生存能力(圖5)。
圖5.PII S49A突變恢復(fù)了Δhik8的糖原含量并挽救其在黑暗條件下的生存能力(點(diǎn)擊查看大圖)
總 結(jié)
綜上所述，該研究不僅系統(tǒng)地解析了碳代謝調(diào)控因子和相應(yīng)靶蛋白之間調(diào)控的特異和協(xié)同性，同時(shí)還首次揭示了二元信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控PII的磷酸化，并進(jìn)而調(diào)控碳氮平衡。由于Hik8是藍(lán)藻生物鐘的重要信號(hào)輸出組分，該研究說明藍(lán)細(xì)菌的碳氮平衡也可能受到生物節(jié)律性調(diào)控。
簡(jiǎn) 介
中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的汪迎春研究員為本文通訊作者。該研究所的黃成成博士和段曉曉博士為該研究論文的共同第一作者。該研究得到國(guó)家科技部、中科院戰(zhàn)略先導(dǎo)計(jì)劃和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目的資助。
中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所公共技術(shù)中心蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)依托高端質(zhì)譜設(shè)備配置和專業(yè)技術(shù)人才隊(duì)伍為所內(nèi)外研究工作提供高水平的科研及技術(shù)服務(wù)。平臺(tái)具有先進(jìn)高端的質(zhì)譜儀器：Orbitrap Exploris™ 480、Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™以及Thermo Scientific™ Orbitrap Elite質(zhì)譜儀等。
關(guān)于培訓(xùn)班~
寫在最后，但同樣重要哦~：
我們深知用戶對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)從樣品前處理，到上機(jī)以及數(shù)據(jù)分析的全流程培訓(xùn)班的需求頗多，故賽默飛將聯(lián)手中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所汪迎春研究員課題組(暨本次分享文獻(xiàn)的通訊作者)，在2025年8月下旬開展第一期約5個(gè)工作日的基于涵蓋蛋白質(zhì)組學(xué)基本原理、樣品制備、數(shù)據(jù)分析及軟件操作(MaxQuant、Perseus、Proteome Discoverer等)的系統(tǒng)性的蛋白質(zhì)組學(xué)培訓(xùn)班，培訓(xùn)班將以小班教學(xué)、實(shí)操為主。
本通知為第一次通知，培訓(xùn)班具體時(shí)間初步定于2025年8月25日至8月29日，培訓(xùn)地址為北京市中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所內(nèi)，其余相關(guān)具體事務(wù)，我們將再后續(xù)發(fā)布專項(xiàng)通知，敬請(qǐng)關(guān)注！
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