酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理，對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個(gè)部分組成：免疫識(shí)別，信號(hào)輸出和數(shù)據(jù)處理。ELISA顯色是ELISA實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵步驟，涉及將無色底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物。這一過程通常在酶催化下完成，如辣根過氧化物酶（HRP）催化TMB或OPD底物的氧化。以下是顯色過程的詳細(xì)說明：

顯色原理：

①　酶催化反應(yīng)：HRP酶催化底物（如TMB或OPD）氧化，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。

②　TMB：HRP作用下，TMB從無色變?yōu)樗{(lán)色，加入硫酸終止液后轉(zhuǎn)為黃色。

③　OPD：HRP作用下，OPD從無色變?yōu)槌赛S色，終止液后轉(zhuǎn)為棕黃色。 

反應(yīng)條件：

①　溫度：適當(dāng)提高溫度可加速顯色，但需遵循試劑盒說明。

②　時(shí)間：定量測(cè)定需嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間，定性測(cè)定可適當(dāng)調(diào)整。

③　避光：OPD底物液受光照會(huì)自行變色，需避光操作。 

顯色過程：

①　加入底物：在酶標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合后，加入相應(yīng)的底物溶液。

②　孵育：根據(jù)試劑盒說明，控制孵育溫度和時(shí)間，確保反應(yīng)充分。

③　終止反應(yīng)：在肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品孔有明顯梯度藍(lán)色時(shí)，加入終止液終止顯色。

顯色時(shí)間：

①　TMB：約40分鐘達(dá)到峰值，隨后逐漸減弱，2小時(shí)后可能消退。

②　OPD：一般在室溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘不再加深。

顯色劑和終止液：

①　TMB：可使用疊氮鈉、SDS等酶抑制劑終止，保持藍(lán)色較長(zhǎng)時(shí)間。

②　OPD：用硫酸終止，產(chǎn)物由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。

影響因素：

①　孵育條件：溫度、時(shí)間和避光是關(guān)鍵。

②　酶和抗體濃度：濃度過低可能顯色不全。

③　樣本和標(biāo)準(zhǔn)品：需充分溶解并避免污染。

④　洗板操作：不正確的洗板可影響顯色。

⑤　試劑盒有效期和保存：過期或保存不當(dāng)?shù)脑噭┛赡軐?dǎo)致顯色異常。

常見問題及解決：

①　顯色偏低或很淡：

②　保證孵育溫度和時(shí)間。

③　做好試劑平衡，避免過期。

④　確保酶和抗體濃度合適。

⑤　檢查洗板操作，避免過度或不正確洗板。

顯色時(shí)間不足：

①　每隔10分鐘觀察，見梯度顯色即可終止。

②　顯色過度或不顯色：

③　檢查試劑有效期，確保酶活性。

④　校準(zhǔn)酶標(biāo)儀，正確設(shè)置波長(zhǎng)。

顯色結(jié)果：

①　吸光度（A值）：表示顯色深淺，用于定量分析。

②　終止液選擇：影響顯色顏色和穩(wěn)定性。

總結(jié)：

ELISA顯色是通過酶催化底物氧化產(chǎn)生有色產(chǎn)物，需嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，確保顯色的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。通過優(yōu)化孵育、洗板、終止等步驟，可以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。