高效液相色譜儀操作流程的五個步驟 

一、樣品與流動相準備

1. 樣品處理

   • 根據(jù)樣品性質(zhì)（固體、液體、半固體）選擇前處理方法，如研磨、溶解、萃取、離心等，確保樣品均勻且無顆粒雜質(zhì)（顆粒會堵塞色譜柱或單向閥）。

   • 用 0.22μm 或 0.45μm 濾膜（有機相樣品用有機系濾膜，水相樣品用水系濾膜）過濾樣品，去除微小顆粒；若樣品濃度過高，需用流動相稀釋至合適范圍（避免超出檢測器線性響應(yīng)區(qū)間）。

   • 將處理好的樣品注入進樣瓶，標記清晰，避免混淆。

2. 流動相配制

   • 選擇色譜純試劑（如甲醇、乙腈）和超純水作為流動相，按方法要求的比例混合（如 80% 甲醇 + 20% 水），混合后需超聲脫氣 10-15 分鐘（去除氣泡，防止基線波動或泵壓異常）。

   • 若流動相含緩沖鹽（如磷酸鹽），需用濾膜過濾（防止未溶解的鹽顆粒堵塞系統(tǒng)），并現(xiàn)配現(xiàn)用（避免緩沖鹽析出或滋生微生物）。

二、儀器開機與系統(tǒng)平衡

1. 開機順序

   • 依次打開打印機、檢測器、泵模塊電源，最后打開工作站軟件（避免電壓波動影響儀器）。

   • 檢查色譜柱連接是否正確（入口接泵出口，出口接檢測器），流動相儲液瓶中溶劑是否充足，排液閥是否關(guān)閉。

2. 系統(tǒng)排氣與平衡

   • 打開泵的排氣閥，設(shè)置低流速（1-2 mL/min），讓流動相流經(jīng)泵和管路，排出內(nèi)部氣泡（觀察管路中無氣泡后關(guān)閉排氣閥）。

   • 按方法設(shè)定流速、柱溫（若需柱溫箱）、檢測器參數(shù)（如紫外檢測器波長、熒光檢測器激發(fā) / 發(fā)射波長），讓流動相持續(xù)流經(jīng)色譜柱，直至系統(tǒng)達到平衡（通常需 30-60 分鐘，判斷標準：基線平穩(wěn)，波動范圍≤0.01 mAU）。

三、方法編輯與參數(shù)設(shè)定

1. 編輯檢測方法

   • 泵：流速（如 1.0 mL/min）、梯度程序（若為梯度洗脫，需設(shè)定不同時間點的流動相比例）。

   • 柱溫箱：設(shè)定色譜柱溫度（如 30℃，保持恒溫可提高保留時間重現(xiàn)性）。

   • 檢測器：根據(jù)樣品性質(zhì)選擇檢測模式（如紫外、熒光、蒸發(fā)光散射），設(shè)定檢測波長、靈敏度等。

   • 進樣量：根據(jù)樣品濃度和檢測器響應(yīng)設(shè)定（如 10 μL）。

   • 在工作站軟件中創(chuàng)建新方法，輸入關(guān)鍵參數(shù)：

2. 方法保存與調(diào)用

   • 保存編輯好的方法，確保參數(shù)無誤（尤其注意梯度程序的時間和比例，避免溶劑切換錯誤損傷色譜柱）。

四、樣品進樣與數(shù)據(jù)采集

1. 進樣操作

   • 用樣品溶液潤洗進樣針 3-5 次（避免殘留溶劑稀釋樣品），抽取過量樣品（如進樣量 10 μL，可抽取 20 μL），排出氣泡后調(diào)整至準確體積。

   • 按儀器提示將進樣針插入進樣口，緩慢推注樣品至定量環(huán)（手動進樣），或通過自動進樣器完成進樣（需提前將進樣瓶放入樣品盤并編輯序列）。

2. 數(shù)據(jù)采集

   • 進樣后立即啟動工作站的數(shù)據(jù)采集功能，實時觀察色譜圖（基線、峰形、保留時間），記錄異常情況（如峰形拖尾、分叉或基線漂移）。

   • 每個樣品檢測完成后，需用流動相沖洗系統(tǒng) 1-2 個柱體積（避免樣品殘留污染色譜柱），再進行下一個樣品檢測。

五、實驗結(jié)束與儀器關(guān)機

1. 系統(tǒng)沖洗

   • 所有樣品檢測完成后，若流動相含緩沖鹽，需先用 10%-20% 有機相水溶液沖洗系統(tǒng) 30 分鐘（去除殘留鹽，防止鹽析出堵塞色譜柱），再用純有機相（如甲醇）沖洗 30 分鐘（保護色譜柱固定相）。

2. 關(guān)機步驟

   • 逐步降低流速至 0，關(guān)閉泵、檢測器、柱溫箱電源，最后關(guān)閉工作站軟件和總電源。

   • 整理實驗數(shù)據(jù)，登記儀器使用記錄（包括樣品名稱、檢測時間、儀器狀態(tài)等），清理進樣瓶和廢液，保持實驗室整潔。

以上步驟需嚴格遵循儀器操作規(guī)程，尤其注意流動相兼容性（如避免強酸性流動相長時間接觸反相色譜柱）和色譜柱保護，以確保儀器壽命和檢測結(jié)果可靠性。

高效液相色譜儀的使用注意事項